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釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化

更新時(shí)間:2013-08-07      點(diǎn)擊次數(shù):7181

 釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備

 
(1)從YPD平板上挑取一個(gè)新鮮的釀酒酵母EBY100單克隆至10 ml YPD液體培養(yǎng)基,30℃,250 rpm 培養(yǎng)過夜。
(2)測(cè)定過夜培養(yǎng)物的OD600值為3.0~5.0之間。
(3)將10 ml YPD過夜培養(yǎng)物稀釋至OD600值為0.2~0.4。
(4)在28~30℃搖床中繼續(xù)培養(yǎng)3~6 hr,使其OD600值達(dá)到0.6~1.0。
(5)于室溫1500 g 離心5 min 收集酵母細(xì)胞,棄上清。
(6)用10 ml 洗液洗酵母細(xì)胞,隨后于室溫1500 g 離心5 min離 心收集細(xì)胞,棄上清。
(7)用1 ml TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞,以每管50 μl 分裝。
 
釀酒酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
 
(1)取50 μl 感受態(tài)細(xì)胞,再加入待轉(zhuǎn)質(zhì)粒各2 μl,混勻。
(2)加入500 μl 轉(zhuǎn)化用溶液(PEG/LiAc,二甲亞砜),彈擊管壁混勻。
(3)30℃水浴1 h,隔15min彈擊管壁混勻。
(4)加入1毫升YPD培養(yǎng)液,30℃搖床培養(yǎng)1小時(shí)。
(5)3500 g 離心5 min ,留沉淀,棄上清。
(6)沉淀用150 μl TE重懸,涂相應(yīng)的SD平板;將平板倒置于30℃培養(yǎng)。
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